[Подлинное пятно] Анализ данных РНК-seq Практический метод Новый биологический сериал (Finnish) E. Eija Korpelainen и другие 9787030564863 Science Press
Вес товара: ~0.7 кг. Указан усредненный вес, который может отличаться от фактического. Не включен в цену, оплачивается при получении.
Описание товара
| Практический метод анализа данных РНК-seq Практический метод | ||
 | Используемая цена | 120.00 |
| Издатель | Science Press | |
| Версия | 1 | |
| Опубликованная дата | Март 2018 года | |
| формат | 16 | |
| автор | ||
| Украсить | Оплата в мягкой обложке | |
| Количество страниц | 0 | |
| Число слов | 310000 | |
| Кодирование ISBN | 9787030564863 | |
Эта книга всесторонне вводит основные принципы и методы анализа данных RNA-seq. Содержание охватывает весь рабочий процесс анализа данных, включая контроль качества, рисунок, сборку, статистическую проверку и анализ метаболических путей.При объяснении теоретических объяснений в книге также используются больше примеров. Не только ученых из биологической информации, но и исследователи, которые даже не имеют соответствующего опыта анализа, могут быть проанализированы с этими случаями.
Глава 1 Введение в RNA-seq 1
1.1 Введение 1
1.2 Разделение РНК 3
1.3 Контроль качества РНК 3
1.4 Подготовка библиотеки 4
1.5 Основная платформа RNA-Seq 7
1.5.1 Illumina 7
1.5.2 SOLID 8
1.5.3 Roche 454 8
1.5.4 Ion Torrent 9
1.5.5 Pacific Biosciences 9
1.5.6 Nano Hole Technology 10
1.6 Применение РНК-seq 11
1.6.1 Белок, кодирующий структуру гена 11
1.6.2 Новый белок, кодирующий ген 12
1.6.3 Количественная оценка и сравнение экспрессии генов 13
1.6.4 Экспрессивное маттипотрансмидное основание генов 14
1.6.5 Одноклеточная РНК-seq 14
1.6.6 Ген слияния 15
1.6.7 Мутация гена 15
1.6.8 не -кодированная РНК 16
1.6.9 Не -кодированная малая РНК 16
1.6.10 Секвенирование продукта амплификации (Ampli-seq) 16
1.7 Выберите платформу RNA-seq 17
1.7.1 Выберите 8 принципов платформы RNA-Seq и режима секвенирования 17
1.7.2 Резюме 20
Ссылки 20
Глава 2 Анализ данных РНК-seq Введение Введение 23
2.1 Введение 23
2.2 Рабочий процесс анализа экспрессии 25
2.2.1 **: контроль качества в чтении. Раздел 26
2.2.2 Шаг 2: Предварительная обработка чтения Раздел 26
2.2.3 Шаг 3: Сравните раздел чтения с ссылкой на геном 26
2.2.4 Шаг 4: Транскрипционная группа руководствуется геномом 27
2.2.5 Шаг 5: Уровень выражения расчета 27
2.2.6 Шаг 6: Экспрессия гена между различными условиями 27
2.2.7 Шаг 7: Визуализация данных в контексте генома 27
2.3 Нижний анализ 28
2.3.1 Аннотация генов 28
2.3.2 Анализ экстракта генов 29
2.4 Автоматический рабочий процесс и трубопровод 29
2.5 Требование к оборудованию 30
2.6 Пример в книге 30
2.6.1 Используйте инструменты командной строки и R 31
2.6.2 Используйте программное обеспечение для чипстеров 31
2.6.3 Пример набора данных 32
2.7 Резюме 33
Ссылка 34
Глава 3 Контроль качества и предварительная обработка 35
3.1 ВВЕДЕНИЕ 35
3.2 Программное обеспечение для контроля качества и предварительной обработки 35
3.2.1 FastQC 35
3.2.2 PRINSEQ 36
3.2.3 Trimmomatic 37
3.3 Проблема с качеством чтения 37
3.3.1 Качество базового щелочка 37
3.3.2 Определенное основание 44
3.3.3 Подключите 46
3.3.4 Длина секции чтения 47
3.3.5 -специфическое отклонение последовательности и не -матч с помощью случайных праймеров Couplet 47
3.3.6 Содержание GC 48
3.3.7 Повторите 48
3.3.8 Загрязнение последовательности 50
3.3.9 Последовательность низкой сложности и Hail 50 Polya 50
3.4 Резюме 51
Ссылки 52
Глава 4 Сравните раздел чтения с ссылкой на геном 54
4.1 Введение 54
4.2 Программа сравнения 54
4.2.1 Bowtie 55
4.2.2 TopHat 58
4.2.3 STAR 62
4.3 Сравнительная статистика и процедуры для файла сравнения операций 65
4.4 В контексте геномной группы, раздел 68 визуального чтения.
4.5 Резюме 69
Ссылки 70
Глава 5 Ассамблея группы транскрипции 71
5.1 Введение 71
5.2 Метод 72
5.2.1 Защита группы группы отличается от сборки генома 72
5.2.2 Сложность реконструкции транскрипционной книги 73
5.2.3 Процесс сборки 73
5.2.4 De Bruijn Рисунок 75
5.2.5 Используйте информацию о изобилии 75
5.3 Предварительная обработка данных 76
5.3.1 Коррекция ошибок чтения 77
5.3.2 SEECER 77
5.4 Сборка на основе чертежа 78
5.4.1 Cufflinks 79
5.4.2 Scripture 80
5.5 Ассамблея De novo 81
5.5.1 Velvet+Oases 81
5.5.2 Trinity 83
5.6 Резюме 87
Ссылка 88
Глава 6 Количественная и аннотированная контроль качества 90
6.1 Введение 90
6.2 Массовый вес на основе аннотаций 90
6.2.1 Инструмент контроля качества на основе комментариев 91
6.3 Количественное исследование экспрессии генов 95
6.3.1 Считайте раздел чтения каждого гена 96
6.3.2 Считайте раздел чтения каждой книги по транскрипции 99
6.3.3 Считайте раздел чтения каждой внешней манеры 103
6.4 Резюме 104
Ссылки 105
Глава 7 РНК-seq.
7.1 Введение 106
7.1.1 Установите R и расширенный пакет 106
7.1.2 Используйте R 107
7.2 Bioconductor Package 108
7.2.1 Программный пакет 108
7.2.2 Пакет примечания 108
7.2.3 Тестовый пакет 109
7.3 Описание Особенности биоконкурнорного пакета 109
7.3.1 ООП функции в R 109
7.4 В R, Gene and Transcription Book 111
7.5 в r, геном 114
7.6 в R, SNP 116
7.7 Формирование нового пакета аннотаций 116
7.8 Резюме 118
Ссылки 118
Глава 8 Различный анализ выражения 119
8.1 Введение 119
8.2 Технологический повтор и биология повторение 119
8.3 Статистическое распределение в данных РНК-seq 120
8.3.1 Повторение биологии, распределение графы и опции программного обеспечения 122
8.4 Слепая 122
8.5 Пример использования программного обеспечения 124
8.5.1 Используйте Cufffdiff 124
8.5.2 Используйте BioConductor Package: Deseq, Edger, Limma 127
8.5.3 Линейная модель, проектная матрица и контрастная матрица 127
8.5.4 Подготовка перед различным анализом экспрессии 130
8.5.5 Пример кода Deseq (2) 131
8.5.6 Визуализация 132
8.5.7. Для справки: пример кода других пакетов биоконкуртировщиков 136
8.5.8 limma 137
8.5.9 SAMSEQ (пакет SAMR) 137
8.5.10 edgeR 138
8.5.11 DESEQ2 Пример кода многофакторного эксперимента 138
8.5.12 Для справки: Пример кода Эджера 141
8.5.13 Пример кода Лиммы 141
8.6 Резюме 143
Ссылки 143
Глава 9 Анализ различных аутсидальных использования 146
9.1 Введение 146
9.2 Входной файл подготовки DEXSEQ 147
9.3 Прочитайте данные в 148
9.4 Посетите Exoncountset Object 149
9.5 Оценка поддержки и основания 151
9.6 Испытательные различия Внешнее подразделение 153
9.7 Визуализация 156
9.8 Резюме 160
Ссылка 160
Глава 10 ПРИМЕЧАНИЕ РЕЗУЛЬТАТ 161
10.1 Введение 161
10.2 Извлечение дополнительных комментариев 161
10.2.1 Комментарий со специализированным пакетом аннотаций с биологическим телом 162 162
10.2.2 Комментарий с поиском Biomart Gene 165
10.3 Анализ онтологии наборов генов с аннотациями 167
10.4 Анализ генетического набора 169
10.4.1 Метод конкуренции с использованием пакета Gostats 170
10.4.2 Самоодержащий метод использования сумки GlobalTest 172
10.4.3 Метод коррекции ведущего отклонения 173
10.5 Резюме 174
Ссылки 174
Глава 11 Визуализация 176
11.1 Введение 176
11.1.1 Тип файла изображения 176
11.1.2 Резолюция изображения 177
11.1.3 Цветная модель 177
11.2 Графика в R 177
11.2.1 Горячий рисунок 178
11.2.2 Вулкан Рисунок 182
11.2.3 мА Рисунок 184
11.2.4 Тип группы хроматина Рисунок 185
11.2.5 Визуализация генов и транскрипционных структур 187
11.3 Полный рисунок 189
11.4 Резюме 190
Ссылки 190
Глава 12 не -код Little RNA 192
12.1 Введение 192
12.2 МикроРНК (miRNA) 193
12.3 Микро РНК бок бок РНК 196
12,4 РНК 196, связанная с Piwi
12.5 Внутреннее молчание РНК 197
12.6 Экзотическая тишина РНК 198
12.7 Transfer RNA 198
12.8 Ядерная РНК 198
12,9 малая сердечная РНК 198
12.10 Улучшенная РНК -производная 199
12.11 Другие некодирующие маленькую РНК 199
12.12 Он используется для обнаружения некодирующих малых методов секвенирования РНК 200
12.12.1 miRNA-seq 201
12.12.2 CLIP-seq 203
12.12.3 Секвенирование группы деградации 205
12.12.4 Глобальное непрерывное секвенирование 205
12.13 Резюме 206
Ссылки 206
Глава 13 Анализ не -кодов данных малого РНК 209
13.1 Введение 209
13.2 Открытие маленькой РНК——miRDeep2 209
13.2.1 Файл GFF 210
13.2.2 Известный файл miRNA FASTA 211
13.2.3 Установите операционную среду 2111
13.2.4 запустить Mirdeep2 213
13.3 miRanalyzer 217
13.3.1 запустить Miranalyzer 219
13.4 Анализ мишени miRNA 219
13.4.1 Расчетный метод прогнозирования 219
13.4.2 Метод искусственного интеллекта 221
13.4.3 Методы на основе эксперимента 222
13.5 Интеграция данных miRNA-seq и mrNA-seq 222
13.6 Маленькая база данных РНК и ресурс 223
13.6.1 Раздел 223 чтения РНК-seq РНК-seq в mirbase 223
13.6.2 Экспрессия miRNA Атлас 225
13.6.3 Clip-seq и Degradation Group-Seq Data Database 226
13.6.4 miRNA и база данных 226
13.6.5 Общая база данных 227 Исследования по сообществу и ресурсам
13.6.6 miRNAblog 227
13.7 Резюме 228
Рекомендации 229
Глава 1 Введение в RNA-seq
1.1 Введение
РНК-seq относится к сбору экспериментов и методов расчета, используемых для определения идентичности последовательности РНК в биологических образцах и изобилии.Следовательно, порядок каждого аденина, цитопримидина, гурина и матки нуклеиновой кислоты в одной молекуле РНК в одной чистин.Экспериментальный метод включает в себя отделение РНК от клеточной, ткани или целого образца животных, и готовит тип LNA типа РНК (виды) в образце, фактическое химическое секвенирование библиотеки и последующий анализ данных биологической информации.Важным различием между РНК-seq и более ранними методами (такими как микрофильмы)*является: текущая платформа RNA-seq очень высока, а новые технологии обеспечивают более высокую чувствительность. Установлено, что новые книги о транскрипции, модели генов и не-нон -Нон-не-не-эпохи обнаружены. Способность кодировать небольшую РНК сильнее.
Метод РНК-seq получен из изменений в поколении технологии секвенирования.** Высокопроизводительное секвенирование обычно относится к методу секвенирования двойного кислорода Sanger.Поскольку капиллярный электрофорез используется для решения длины фрагментов нуклеиновой кислоты, стандартный эксперимент по электрофорезу капилляра может использовать 96 трубок для волос, а длина последовательности составляет от 600 до 1000 оснований, что приводит к примерно 100 000 щелочных последовательностей.Секвенирование второго поколения, также известное как секвенирование следующего поколения (NGS), относится к количеству секвенирования в эксперименте секвенирования, может достигать миллионов.Типичный эксперимент NGS может содержать реакции секвенирования на 6000 мкл 100 нуклеотидов (NT), генерируя информацию о последовательности 600 миллиардов оснований.
Третий -генерационный метод секвенирования также является большим параллелью и использует синтетическое химическое секвенирование, но использует одну молекулу ДНК или РНК в качестве шаблона с одной молекулой.Реакция секвенирования каждого эксперимента на платформе секвенирования третьей генерации составляет несколько миллионов человек, но длина последовательности каждой реакции может быть длиннее, а последовательность последовательности в пределах 1500 нт может быть легко секвенирована.
Данные, полученные из эксперимента RNA-Seq, могут генерировать новые знания, и новая книга о транскрипции, которая кодирует белок в стволовых клетках эмбриона с характеристиками транскрипционных книг, экспрессируемых в клетках опухоли кожи.Вопросы, которые можно задать, включают: каковы различия в уровне экспрессии генов в нормальных клетках и раковых клетках?Какие изменения будут происходить на уровне экспрессии генов в клеточных штаммах, в которых отсутствует генетическая клетка?Каковы различия в экспрессии генов в клеточных штаммах до и после мутагенного лечения?Какие гены поднимаются во время развития мозга?Какая книга транскрипции существует в коже, но не существует в мышцах?Как изменилось генетическое пятно во время стресса окисления?В образцах образцов эмбриона человека, какой новую miRNA мы можем найти?Вы можете видеть, что сфера действия вопроса, который вы можете задать, широкий.
Технология РНК-seq указывает на то, что текущие знания общих аннотаций генетических структур и генов (от биологии одноклеточной моды до клеток человека) все еще довольно плохое, поэтому люди проявляют больше интереса к ожиданиям транскриптомики.Новые данные с платформы RNA-seq показывают обширное разнообразие генетических структур, выявляют новые неизвестные гены и проясняют мелкие и длинные некодирующие книги транскрипции [1-4].Позднее исследование предоставило много данных для многих новых видов с очень ограниченной информацией о транскрипции.Что касается темпов исследований, в индустрии секвенирования существует известная аналогия: снижение затрат на секвенирование быстрее, чем закон Мура.В дополнение к снижению стоимости, способность секвенирования также значительно улучшилась, что приносит большие ожидания для людей.
Эта книга посвящена практическому методу анализа данных в RNA-seq; однако, если экспериментальный метод не введен, эти методы анализа не могут быть описаны.В этой вступительной главе мы предоставим некоторые необходимые фон для введения некоторых типичных процедур (протокол), предоставить рабочий процесс и приведем некоторые примеры успешных приложений.В то время надеется, что читатели могут лучше понять весь процесс, шаг за шагом, от концепции проекта визуализации и объяснения результатов.
Типичный процесс РНК-seq показан на рисунке 1.1.Верхняя часть рабочего процесса показывает этапы влажного лабораторного, а нижняя часть нижней части-этапы обработки и анализа данных.
Рисунок 1.1 Общий план эксперимента RNA-seq.Для Clip-seq, miRNA-seq и General RNA-seq метод RNA-seq показывает рабочие процессы от организации до данных.
1.2 Разделение РНК
РНК обычно отделяется от свежих или замороженных клеток или образцов ткани, используя коммерческий комплект, такой как РНКези (Цяген Хильден, Германия), Тризол (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) или RIBOPURE (Ambion, Austin, TX). Есть много других комплектыПреимущества этих наборов просты в использовании, и они могут создать большое количество общей РНК.Существуют также высокопроизводительные системы разделения РНК, которые в основном зависят от РНК, прикрепленной к магнитным частицам, что удобно для их элюирования и разделения.Также можно отделить РНК от ткани, фиксированной в растворе формальдегида, хотя это не идеально.Чтобы предотвратить деградацию РНК, образец может быть пропитана в реагентах РНК, таких как Rnalater (Ambion) или частичное лечение, и хранить фенолидальным раствором (Trizol).На этом этапе система столбцов также может быть использована для конденсации образца РНК в конкретный класс, такой как небольшая РНК.В качестве альтернативы вы можете извлечь общую РНК из образца, а затем выбрать размер полиакриламидным гель -электронгайтом.
Почти во всех случаях разделения общей РНК образец будет загрязнен ДНК генома. Это неизбежно, и даже если загрязнение невелико, РНК-seq в конечном итоге захватит эти загрязнители из-за его чувствительности и потока*.Следовательно, перед приготовлением библиотеки общие образцы РНК, которые разделены ферментами ДНК (ДНКаза), обычно используются для переваривания загрязненной ДНК.Как только загрязненная ДНК была устранена, реагент, предоставленный большинством ферментов ДНК, может привести к потере ферментов ДНК.Сумма общей РНК, необходимую для подготовки библиотеки RNA-seq, отличается.Стандартные библиотечные правила требуют 0,1 ~ 10&Общая РНК MU; G, правила с высокой чувствительностью могут генерировать библиотеку с меньшего до 10 пг.Он популяризирует метод отделения РНК от одной ячейки, а также разрабатывает специальный комплект для этих приложений.
1.3 Контроль качества РНК
Перед подготовкой библиотеки РНК должна быть проверена на ее деградацию, чистоту и количество.Есть несколько платформ для этого шага.Нанодроп и аналогичные устройства обычно измеряются флуоресцентное вдыхание образцов нуклеиновой кислоты при 260 нм и 280 нм.&Жидкость MU;Оборудование легко использовать, результаты могут быть получены через несколько секунд, и многие образцы могут быть обработаны одновременно.Поскольку устройство измеряет всасывание образцов, оно не может отличить РНК и ДНК, поэтому оно не может показать, загрязнен ли образец РНК ДНК.Кроме того, разлагаемая РНК дает аналогичное чтение, аналогичное полной РНК, поэтому мы не можем понять качество образца.Тем не менее, значение поглощения света 260/280 предоставит некоторую информацию о загрязнении белка.
Поскольку образец с трубкой пипетки достиг предела общей лаборатории (Pipettor) с пипеткой, в диапазоне*низкой концентрации (NG/Μ l) Точность измерения может быть сложной задачей.Кубитфлюрометр (Life Technologies) и аналогичные системы измеряют флуоресценцию производных нуклеиновой кислоты, поэтому вы можете напрямую измерить РНК или ДНК в образце.Используйте значение измерения стандартных образцов низкой концентрации и поместите значения флуоресценции на калибровку стандартных образцов, чтобы вернуться к прямой линии, а затем нарисуйте флуоресцентное значение измерения образца на возвратной линии. Широкое измерение.Кроме того, менее 1&МУ;Несмотря на простое использование, эти системы по -прежнему не обеспечивают какого -либо измерения деградации.Чтобы решить эту проблему, необходимы другие устройства.
Agilente Bioanalyzer - это система, которая используется для измерения нуклеиновой кислоты на основе микрофлюидной способности.Он сочетает в себе преимущества небольшого объема и высокой чувствительности и использует электрофорез для различения размер образцов нуклеиновой кислоты.При использовании образца размера размер и количественный характер РНК в образце предоставляют ключевую информацию о концентрации и качеством нуклеиновой кислоты.Разрушенная РНК будет отображаться как мазок при низком молекулярном качеством, а полная общая РНК будет отображать крутые 28 -е и 18 -е пики.Система Bioanalyzer содержит микро -хип, которая загружает управление размером и может измерять до 12 образцов за раз.Образец смешивают с полимером и флуоресцентным красителем, а затем загружают и измеряют капилляром.Для пользователей, которые более привыкли к традиционному гелевому электрофорезу, интегрированные конвейеры анализа данных на приборе также будут отображать электрофоретические данные в гелевые изображения.Пример анализа биоанализера показан на рисунке 1.2.
Рисунок 1.2 Пример анализа биологического анализатора Aglen показывает качество РНК.Лестничная диаграмма (лестница) и образцы отображаются.
1.4 Подготовка библиотеки
Перед секвенированием РНК в образце была преобразована в библиотеку кДНК, которая представляет все молекулы РНК в образце.Этот шаг состоит в том, чтобы выполнить этот шаг, потому что молекулы РНК не напрямую секвенированы на практике, а секвенируют ДНК. Это связано с тем, что ДНК обладает хорошей химической стабильностью и более подходит для химии секвенирования и каждой платформы секвенирования.Следовательно, библиотека имеет две цели: ** - это РНК, представляющая РНК в образце; вторым является преобразование РНК в ДНК.Каждая платформа секвенирования РНК (такая как Illumina, Solid, Ion Torrent) имеет свои собственные конкретные правила, поэтому нет необходимости предоставлять отдельные процедуры для каждой платформы секвенирования.Библиотечные правила и наборы каждой коммерческой платформы можно найти на веб -сайте компании (Таблица 1.1).
Таблица 1.1 Основная платформа RNA-seq и их общие функции
Существуют также третьимипартийные подготовки к библиотеке для подготовленных наборов и успешно используются.Вы также можете использовать в целом доступные молекулярные биологические компоненты для создания собственных наборов, хотя нет удобства, оптимизации и поддержки коммерческих продуктов.Здесь мы представляем типичные библиотечные правила шагов платформы Illumina RNA-Seq.Схематическая диаграмма этапов показана на рисунке 1.3.
Основные шаги для подготовки библиотеки включают следующую работу:
1) Получить 1 ~ 10Μ g чистый, неповрежденный, общая РНК, которая проверяет качество.Требуемое количество требуется от приложений и платформ.
2) Чистая мРНК из общей РНК.Обычно это завершается отжигом общей РНК для магнитных шариков олигонуклеотида DT (Oligo-DT).Два раунда очистки могут быть выполнены, чтобы перейти из олигонуклеотидного DT и другой РНК, если только специально -специфическое связывание.Высвобождать или изолировать мРНК из олигонуклеотида DT.
3) Используйте реагент фрагментации, чтобы сделать очищенную фрагментацию мРНК.Это разбит цепь мРНК на несколько небольших фрагментов.
4) Используйте гексамерский праймер, чтобы добавить большую мРНК в мРНК.
5) Используйте реверсирующие ферменты, чтобы отменить фрагментную мРНК для генерации кДНК.
6) Вторая цепь синтетической кДНК и удаления РНК.Продукт будет двойной кДНК (кДНК DS).
7) Чистая кДНК DS из свободного нуклеотида, ферментов, буфера и РНК.Например, он может быть завершен, объединив ДНК с использованием шариков обратимой твердофазной иммобилизации (SPRI).Преимущество использования этих косметических шариков состоит в том, что после связывания шарики можно промыть, и кДНК DS, оставленная на шарике, очищается.После промывания DS -кДНК может быть элюирована из шарика для следующей реакции.
8) выполняется конечное восстановление очищенной DS -кДНК Eluing.
9) DS кДНК, восстановленная в конце.Это также может быть завершено на бусинках SPRI.
10) 3 -красовая кДНК DS элюированного конца 3″ конец преобразуется в аденоциты.
Рисунок 1.3 Диаграмма, приготовленная библиотекой РНК-seq.
11) Подключите разъем к кДНК DS, восстановленной в конце.Разъем будет подключен к обоим концам кДНК DS.Эти соединения могут индексировать каждую библиотечную реакцию.Другими словами, каждый разъем может иметь 6 моноцитов -нуклеотид в последовательности разъема.Использование различных индексов для каждой библиотеки используется, чтобы позволить библиотеке использоваться для секвенирования позже, но отслеживание последовательности все еще разрешено отслеживать в исходную библиотеку на основе соединительной последовательности.
12) DS кДНК, которая подключена к разъему и конец меридиана.Это также может быть завершено через Spri Beads.
13) Библиотека обогащения производится посредством усиления полимеразных цепных реакций (ПЦР).Используйте последовательность из сустава в качестве праймера и используйте несколько раундов (12 ~ 16 раундов), чтобы расширить существующую последовательность.
14) Очистка кДНК DS, которая связана с обогащением ПЦР и кДНК DS, закрепленной до конца.Это тоже самое